Arash Ghalehgolabbehbahani, Ph.D.1, Jean Bertrand Contina, Ph.D.2, Madhav Dhakal, Ph.D.1, Andrés Smith, Ph.D.1 y Dinesh Panday, Ph.D.3, *
1Rodale Institute, Kutztown, Pensilvania, 19530
2Rodale Institute Centro Orgánico del Medio Oeste, Marion, IA, 52302
3Rodale Institute- Centro Orgánico Pocono, Blakeslee, PA, 18610
*Autor correspondiente: dinesh.panday@rodaleinstitute.org
Arash Ghalehgolabbehbahani y Dinesh Panday han contribuido igualmente a este trabajo.
Resumen
Se realizó un estudio en invernadero para evaluar el efecto del biofungicida RootShield.+ y luz ultravioleta-C (UV-C) sobre el rendimiento y los parámetros de crecimiento fisiológico del brócoli (Brassica oleracea var. itálico) microvegetales. Los tratamientos se dispusieron mediante un diseño de bloques completos al azar con cuatro repeticiones. El principal patógeno transmitido por el suelo se detectó analizando plantas infectadas que pertenecen al filo de los zigomicetos. Si bien los hongos antipatógenos probados tuvieron un efecto significativo en el rendimiento de los microverdes, la aplicación de UV-C no afectó al patógeno. Trichoderma tratado con suelo recibió el mayor rendimiento. La UV-C puede ser fundamental para el manejo de plagas en la producción de microverdes orgánicos, lo que requiere una investigación fisiológica detallada.
Keywords: Brócoli; microverde; sistema orgánico regenerativo; patógeno transmitido por el suelo; UV-C
Introducción
Los microvegetales son brotes de vegetales inmaduros que se cosechan entre 7 y 21 días después de la germinación, una vez que las hojas cotiledóneas se han desarrollado con un conjunto de hojas verdaderas (Galieni et al., 2020; Zhang et al., 2021). Estas verduras tiernas son conocidas por su textura y sabor concentrado, lo que las convierte en complementos populares para ensaladas, sándwiches y otros platos (Turner et al., 2020). Los microgreens pueden considerarse mejores sustitutos de los brotes debido a su rico contenido nutricional y su sabor y sabor más intensos. Además, los microvegetales son ricos en vitaminas (p. ej., vitamina C), minerales (p. ej., Cu y Zn) y fitoquímicos, incluidos carotenoides y compuestos fenólicos, que actúan como antioxidantes en el cuerpo humano (Yadav et al., 2019; Zhang et al., 2021). Butkutė et al. (2018) observaron un contenido de Zn hasta 3.2 veces mayor en microvegetales que en semillas crudas y germinadas de leguminosas pequeñas. Los microgreens mostraron un rango de contenido total de clorofila de 12.35 a 112.62 mg 100 g-1, más rico que los brotes (de la Fuente et al., 2019). La clorofila y los carotenoides son los principales pigmentos fotosintéticos de coloración que afectan la elección de microvegetales y el valor económico de los clientes (Žnidarčič et al., 2011).
Muchos productores de microgreens luchan por controlar y optimizar los factores climáticos asociados con la temperatura y la humedad. Los niveles de humedad superiores al 75% están relacionados con la proliferación de bacterias y hongos en los tejidos verdes que provocan una pérdida de rendimiento (Hamilton et al., 2023). Otros desafíos agronómicos que enfrentan los productores incluyen bajas tasas de germinación asociadas con una mala calidad de las semillas, una calidad y cantidad de luz desfavorables y la falta de humedad suficiente para la germinación y el crecimiento de las plantas (Hernández-Adasme et al., 2023; Senevirathne et al., 2019). . Los productores de microverdes enfrentan desafíos adicionales relacionados con la seguridad, la regulación y la certificación de los alimentos microverdes. Alrededor del 13 % de los brotes transmitidos por alimentos en EE. UU. estuvieron relacionados con productos frescos (Carstens et al., 2019). Es ampliamente conocido que los productos frescos derivados de microvegetales están expuestos a diversas fuentes de contaminación del suelo y el agua de riego (Alegbeleye et al., 2018). Los microvegetales están expuestos a patógenos foliares y transmitidos por el suelo que interfieren con su crecimiento y desarrollo. La patogénesis se caracteriza por una interacción abierta entre el huésped y el patógeno que conduce a la proliferación de unidades microbianas infectivas en toda la raíz del huésped o en los tejidos foliares al tiempo que interfiere con sus funciones. La intensidad y proliferación de la enfermedad dependen del nivel de susceptibilidad de la planta, la infecciosidad y virulencia de los patógenos y la propiciación del medio ambiente (Agrios, 2005). Por lo tanto, una combinación de baja resistencia en la planta, un patógeno virulento y un ambiente húmedo podría desencadenar una infestación patógena masiva que conduciría a la pérdida total de la cosecha. Las hortalizas y los microvegetales son sensibles a la pudrición de las raíces, lo que puede provocar el marchitamiento de las plántulas causado por Pythium spp., Fusarium spp., o Rizoctonia especies (Martins et al., 2022; McGehee et al., 2018; Riaz et al., 2021).
Se pueden utilizar diferentes estrategias de la caja de herramientas de los agricultores para prevenir, mitigar o controlar enfermedades. Una de las estrategias para controlar las enfermedades de las plantas es utilizar enfoques biológicos que se dirijan directamente a los patógenos. Los enfoques biológicos para el control de enfermedades incluyen un arsenal de productos derivados de plantas, metabolitos microbianos y agentes microbianos. el genero Trichoderma, un hongo filamentoso cosmopolita transmitido por el suelo, es ampliamente conocido y estudiado por sus capacidades antagónicas inherentes para controlar patógenos de plantas y ha sido ampliamente utilizado como agente de biocontrol (Contina et al., 2017; Harman et al., 2004; Druzhinina et al., 2011). Trichoderma especies utilizó mecanismos múltiples para controlar los patógenos transmitidos por el suelo e incluyen (Harman et al., 2004): (1) parasitismo directo de los patógenos; (2) producción de enzimas hidrolíticas; (3) competencia por espacio y recursos; (4) colonización de raíces; (5) promoción del crecimiento de las plantas; y (6) inducción de resistencia sistémica en el huésped. especies variadas de Trichoderma Se ha demostrado que controlan significativamente los nematodos (Contina et al., 2017; Sahebani y Hadavi, 2008), Fusarium especies (Erazo et al., 2021), Phytophthora spp., Pythium especies (McGehee et al., 2018), Rizoctonia especies e insectos (Poveda, 2021).
La luz ultravioleta también se emplea para desinfectar contaminantes microbianos inhibiendo su crecimiento. Entre los distintos tipos de radiación UV, la UV-C (200-280 nm) demuestra el impacto germicida más potente. La exposición a la luz ultravioleta también provoca un retraso en la germinación de las esporas y una mayor resistencia a los patógenos de las plantas al facilitar la acumulación de sustancias antimicrobianas, como los terpenoides (Cornell Chronicle, 2019). Un descubrimiento innovador que destaca la eficacia de la aplicación de luz ultravioleta durante la noche para la erradicación de hongos ha inspirado a los investigadores a utilizar este método para controlar diversas enfermedades fúngicas en cultivos hortícolas (Suthaparan et al., 2012).
En respuesta a la limitada información y técnicas disponibles para controlar enfermedades en la producción de microverdes orgánicos regenerativos, se llevó a cabo un estudio para desarrollar un enfoque integrado que combina la aplicación de hongos antipatógenos como control biológico y la utilización de luz ultravioleta como método físico de manejo de enfermedades. Brócoli (Brassica oleracea) fue elegido como caso de estudio debido a su alta susceptibilidad a enfermedades microbianas transmitidas por el suelo. Las observaciones de este estudio servirán como base para diseñar un proyecto de investigación integral para mitigar el impacto de diversas enfermedades microbianas en los sistemas de producción de microverdes basados en el suelo. En este estudio, evaluamos los efectos indirectos de los hongos antipatógenos y la irradiación UV-C sobre la infestación microbiana midiendo el rendimiento y otros parámetros de crecimiento fisiológico (como la longitud del tallo y la raíz) de los microvegetales. En el futuro se estudiarán las investigaciones sobre el impacto de los tratamientos sobre los agentes patógenos transmitidos por el suelo.
Materiales y Métodos
Condiciones de invernadero
Esta investigación se realizó en un invernadero en Blakeslee, Pensilvania (zona de rusticidad de las plantas 5b del USDA (-26.1 °C a -23.3 °C)). La temperatura dentro del invernadero se mantuvo en 24.4°C y el nivel de humedad en 45% durante todo el período de estudio. Las plantas se mantuvieron bajo un fotoperiodo de luz: oscuridad de 12 h: 12 h y se regaron utilizando el método de llenado de la bandeja inferior hasta tres veces al día según los requisitos. Se utilizó un arreglo factorial (2×2) basado en un diseño de bloques completos al azar para evaluar la influencia de la luz ultravioleta (UV) y una combinación de dos aislados de hongos antipatógenos en el rendimiento de microvegetales producidos a partir de semillas de brócoli. El ensayo se repitió tres veces desde diciembre de 2022 hasta marzo de 2023. También se recolectaron muestras y se enviaron a un laboratorio de la Clínica de Enfermedades Vegetales de la Universidad Penn State, University Park, PA, para identificar la fuente de la infestación de la planta. Los resultados de las pruebas de patología en plantas dañadas recolectadas de las unidades de control ilustraron la presencia de un patógeno perteneciente al zigomiceto (Rhizopus or Mucor) filo.
Material vegetal
Las semillas de brócoli se adquirieron de Johnny's Seeds, Fairfield, ME (82% de capacidad de germinación). Dado que las semillas de brócoli y los microvegetales son particularmente vulnerables a las infestaciones microbianas en comparación con muchos otros cultivos, esta investigación se centra en utilizarlos como estudio de caso. Para cultivar microvegetales de brócoli, se llenaron bandejas de plántulas con 3.4 kg de tierra orgánica para macetas y se distribuyeron uniformemente 18 gramos de semillas de brócoli en la superficie del suelo. Después de la siembra, las semillas se irrigaron inmediatamente y luego las bandejas se trasladaron a una cámara oscura para facilitar la germinación. Después de un período de germinación de 72 horas, las plantas germinadas se transfirieron de la cámara oscura a las mesas del invernadero para una duración de crecimiento de 7 a 10 días. La evaluación del rendimiento se realizó utilizando métodos de muestreo destructivos.
Inoculación
RootShield Plus (RS+), un fungicida listado por OMRI aprobado para producción orgánica, se incorporó al suelo para proporcionar una fuente de dos aislados de Trichoderma (Trichoderma harzianum cepa T-22 y Trichoderma virenes cepa G-41). Se mezclaron 5.8 gramos de RS+ con 3.4 kg de tierra para macetas antes de sembrar para cada bandeja tratada con Trichoderma.
Exposición a la luz ultravioleta
En cada réplica, tres bandejas de brócoli plantado se sometieron a exposición a UV-C (200-280 nm) a 150 JM.-2 (a 3 pulgadas de la fuente de luz) durante cinco segundos usando el kit HVAC germicida de la serie ECO (American Ultraviolet, Lebanon, IN). La duración de la exposición a los rayos UV-C se seleccionó en función de la fuente de luz y la distancia de exposición para lograr una reducción microbiana sin comprometer la composición y calidad de los alimentos.
Evaluación del crecimiento de las plantas.
Después de un período de 10 a 12 días después de la siembra, los microvegetales se cosecharon manualmente y el rendimiento de productos frescos se midió y comparó cuidadosamente entre los distintos tratamientos. Un día antes de la cosecha, se midió la cobertura fraccionaria del dosel verde (%FGCC) como índice de crecimiento de las hojas verdes. Para evaluar el %FGCC, se tomaron fotografías del follaje utilizando la cámara de un teléfono inteligente y se analizaron mediante la aplicación Canopeo. Se contaron píxeles verdes con el programa para evaluar la proporción de hojas verdes y suelo desnudo, convertidos a un porcentaje de cobertura del dosel. El efecto directo de los tratamientos se evaluó comparando el rendimiento y el %FGCC en bandejas tratadas con unidades de control no tratadas.
Análisis estadístico
El análisis de los datos se realizó con el software estadístico R. Se utilizó un modelo transformado lineal para evaluar el efecto de RootShield y la exposición a la luz ultravioleta sobre el crecimiento y desarrollo del brócoli. También se realizó un análisis de varianza de dos vías (ANOVA) para investigar la interacción entre diferentes grupos de tratamientos en α < 0.05. Además, se desarrolló un modelo de correlación para investigar la relación entre la cobertura del dosel (%FGCC) y el rendimiento cosechado. Este modelo de correlación facilitó la comprensión de cómo las variaciones en la cobertura del dosel influyeron en el rendimiento final de los microvegetales de brócoli, proporcionando información valiosa para futuras prácticas agrícolas. También se realizó ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Tukey para comparar las medias de los parámetros medidos entre los tratamientos.
Resultados y discusión
Si bien los hongos antipatógenos probados afectaron significativamente el rendimiento de los microverdes, la exposición a la luz UV-C no provocó un cambio significativo en este parámetro medido (Tabla 1). Unidades experimentales tratadas únicamente con Trichoderma mostró un mayor rendimiento, con un promedio de 25.8 gramos de producción de microverdes frescos (Fig. 1). A esta cantidad le siguieron 21.5 gramos de producción de microverdes en bandejas tratadas con una combinación de Trichoderma y luz UV-C. La diferencia observada en el rendimiento puede atribuirse a la relación antagónica entre la aplicación de luz UV-C y los hongos antipatógenos. Smaetz-Baron et al. (1997) informaron una restricción significativa en la tasa de germinación de Trichoderma cuando se expone a la luz UV-C. Sin embargo, se encontró que el efecto de la aplicación de UV-C no era significativo; las bandejas tratadas con UV-C solo produjeron un rendimiento ligeramente mayor que las unidades de control no tratadas.
Nota: a NS p > 0.05 *0.01 < p<0.05 **p<0.01
El análisis de varianza reveló una interacción no significativa entre los tratamientos probados para todos los parámetros medidos (Tabla 1). También se observó un impacto notable de los hongos antipatógenos sobre la longitud del tallo y el %FGCC. Las bandejas tratadas con UV-C y Trichoderma exhibió los tallos más largos, con una longitud promedio de 59.6 mm. En contraste, las unidades de control tenían los microvegetales de brócoli más cortos, con una longitud de tallo promedio de 50.86 mm (Tabla 2).
Por otro lado, la longitud de la raíz no mostró diferencias significativas entre los tratamientos, oscilando entre 22.41 y 24.96 mm. A pesar del efecto no significativo de Trichoderma a lo largo de los microvegetales observamos un sistema radicular auxiliar bien desarrollado y robusto en bandejas tratadas con hongos antipatógenos (Fig. 2). Al final del experimento, se midió la longitud total de las raíces de microgreen, donde la longitud de la raíz aumentó cuatro veces en las semillas de microgreen tratadas con Trichoderma (promedio = 4 cm) en comparación con ningún Trichoderma (promedio = 1 cm). La aplicación de hongos antipatógenos también condujo a un promedio de %FGCC un 26% mayor que las unidades no tratadas (Tabla 2). El aumento del %FGCC indicó una mayor cantidad de células de clorofila desarrolladas, lo que condujo a una tasa de crecimiento más rápida, una mayor cobertura del dosel y un mayor rendimiento. Esta relación fue respaldada por una correlación positiva significativa entre el %FGCC registrado y el rendimiento cosechado (Fig. 3).
Nota: La media seguida de diferentes letras minúsculas es significativamente diferente en P <0.05.
Brócoli inoculado con Trichoderma logró un mayor crecimiento y desarrollo que aquel con suelo no modificado. Nuestro experimento demostró que Trichoderma Los inoculantes actuaron como bioestimulantes para mejorar el crecimiento de las plantas y como agentes de biocontrol para proteger las plantas contra patógenos. Estudios similares han demostrado que Trichoderma especies puede colonizar la epidermis de la raíz y aumentar la capacidad de la planta para aumentar la absorción de nutrientes y aumentar significativamente su crecimiento (Harman, 2006). La promoción del crecimiento vegetal se ha relacionado con la capacidad de Trichoderma especies para secretar y liberar sideróforos que se utilizan para quelar otros metales como manganeso, níquel y zinc y hacerlos disponibles para la absorción de las plantas (Saha et al., 2013). Otros estudios han encontrado que algunos Trichoderma Las especies tienen la capacidad de solubilizar fosfatos, compuestos similares a hormonas, que pueden mejorar la absorción de nutrientes de las plantas (Lopez-Bucio et al., 2015; Rudresh et al., 2005).
Aunque este estudio no evaluó directamente el proceso de biocontrol, la falta de desarrollo de enfermedades en el suelo modificado con Trichoderma indica que los hongos de biocontrol proporcionaron una capa protectora al tribunal de infecciones. Estudios anteriores han dilucidado el proceso de control de enfermedades de Trichoderma e implicó la producción de compuestos bioactivos, enzimas que degradan la pared celular y metabolitos secundarios (Contreras-Cornejo et al., 2016; Harman, 2006). Otros estudios han encontrado que Trichoderma puede parasitar directamente a los patógenos a través de la colonización de hifas, la competencia por los recursos y la inducción de resistencia sistémica en la planta huésped (Contina et al., 2017; Harman et al., 2004; Van Loon, 2007).
Los servicios agroecológicos brindados por Trichoderma especies a menudo están limitados por los factores ambientales del suelo (elementos abióticos) y la influencia de la red trófica del suelo (elementos bióticos). Los estudios han encontrado que Trichoderma la proliferación en el medio dependió principalmente de la temperatura del suelo y las condiciones de humedad (Eastburn y Butler, 1987; Widden y Abitbol, 1980). Se encontró que varios factores bióticos están estrechamente relacionados con T. harzianum distribución en el suelo, incluida una asociación positiva con poblaciones bacterianas (Hadar et al., 1984). En un estudio reciente, T.virens y T. asperellum fueron expuestos a luz ultravioleta y sufrieron modificaciones en su estructura genética, y los mutantes obtenidos pudieron controlar con éxito los patógenos vegetales en mayor medida que los tipos salvajes (Alfiky, 2019). Sin embargo, en nuestro estudio, la exposición de T.virens y T. harzianum no mejoraron sus actividades de biocontrol ni sus capacidades bioestimulantes en comparación con el tratamiento no expuesto. Estas ambigüedades podrían explicarse por el hecho de que sólo Trichoderma Las cepas, cuando se exponen a la luz ultravioleta, pueden aumentar sus actividades bioestimulantes y biocontroladoras.
Las investigaciones futuras deberían centrarse en dilucidar los eventos de mutagénesis que podrían ocurrir cuando los microvegetales, T.virensy T. harzianum están expuestos a la luz ultravioleta y para determinar el impacto en el crecimiento y desarrollo de las plantas, así como la capacidad de Trichoderma especies proliferar en el suelo y actuar como bioestimulantes y agentes de biocontrol. Mapear la estructura genética donde podrían ocurrir mutaciones ayudaría a identificar genes específicos asociados con la mejora de las propiedades beneficiosas de Trichoderma especies y potencialmente agregaría mutagénesis a la caja de herramientas para controlar las enfermedades de las plantas y aumentar el crecimiento de las plantas. Pretendemos continuar con nuestra línea de estudio y ampliarla para explorar interacciones específicas entre la planta huésped, los patógenos, los agentes de biocontrol y el medio ambiente.
Expresiones de gratitud: Los autores agradecen a Jennifer Salazar y a todo el equipo de Pocono Organics en Blakeslee, PA, por su invaluable apoyo durante el estudio. Además, los autores desean extender su agradecimiento a John Siepel de American Ultraviolet en Lebanon, IN, por proporcionar generosamente lámparas UV y asistencia técnica.
Fondos: Este proyecto fue financiado por Pocono Organics y parcialmente apoyado por el Instituto Nacional de Alimentación y Agricultura, Departamento de Agricultura de EE. UU., a través del programa de Investigación y Educación sobre Agricultura Sostenible del Noreste con el número de subadjudicación [ONE22-413].
Conflicto de intereses: Los autores declaran que no existe conflicto de intereses.